Sterilisasi dan Pembuatan Media

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan mikroorganisme. Fungsi dari sterilisasi ini yaitu untuk menghilangkan seluruh mikroorganisme. Prinsip sterilisasi ialah membunuh mikroba dengan sporanya. Hal ini sesuai dengan pendapat Gruendemann dan Fernsebner (2006), yang menyatakan bahwa sterilisasi adalah suatu proses yang menghancurkan semua bentuk kehidupan mikroba, termasuk spora. Tujuan sterilisasi dalam mikrobiologi untuk mendapatkan keadaan steril. Mikroorganisme-mikroorganisme dapat dimatikan oleh panas, betapriolakton dan larutan kimia.

Macam-macam Sterilisasi

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu secara mekanik, fisik, dan kimiawi.

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) yaitu teknik sterilisasi dengan menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 atau 0,45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Cairan yang akan disterilkan dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk menterilkan cairan yang mudah rusak jika terkena panas, atau mudah menguap (volatile), misalnya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran. Pemanasan biasa dilakukan dengan pemijaran (dengan api langsung), panas kering, uap air bertekanan. Adapun penyinaran dilakukan dengan UV. Sterilisasi fisik dengan uap air bertekanan menggunakan autoclave. Semua alat – alat yang akan di sterilisasikan dibersihkan kemudian dicuci dengan air bersih. Selanjutnya dikeringkan dengan tissue roll lalu dibungkus dengan kertas dan aluminium foil. Setelah dibungkus, disterilkan pada autoclave tekanan 1 atm (121⁰C) selama kurang lebih 15 menit.

 Autoclave

Autoclave bekerja mensterilisasi dengan penggunaan uap air jenuh pada tekanan 1 atm dengan suhu 121⁰C selama 15 menit.Autoclave terutama ditujukan untuk embunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100⁰C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121⁰C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit. Perhitungan waktu sterilisasi autoclave dimulai ketika suhu di dalam autoclave mencapai 121⁰C. Jika objek yang disterilkan cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoclave akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121⁰C untuk waktu 10-15 menit. Hal ini sesuai dengan pendapat Lansing M. Prescott  dkk (2005) yang menyatakan bahwa sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave yang menggunakan tekanan yang disebabkan uap air.

3. Sterilisasi secara kimiawi

Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. Alkohol bersifat merusak membran sel dari bakteri, sehingga terjadi denaturasi protein (pengubahan struktur protein sehingga menjadi tidak aktif). Sterilisasi ini dilakukan dengan membersihkan meja kerja terlebih dahulu. Kemudian alat-alat yang akan di sterilisasikan dicuci dengan sabun. Kemudian dikeringkan dengan tissu. Lalu disemprot dengan alkohol 70%.

  
Agar sterilisasi dilakukan secara sempurna maka diperlukan teknik-teknik sehingga tidak ada mikroorganisme lain yang mengontaminasi media.

Media 

Media merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Mikroorganisme dapat berkembangbiak secara alami atau dengan campur tangan manusia. Pada pembuatan media ini, harus dipahami jenis-jenis nutrien yang diperlukan oleh mikroorganisme dan juga keadaan lingkungan fisik yang dapat menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Media berfungsi sebagai tempat tinggal, sumber makanan, dan penyedia nutrisi bagi mikroorganisme yang akan dibiakan pada media, selain itu media juga berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan, dan menyimpan mikroorganisme dalam waktu lama di laboratorium. Media juga dapat digunakan untuk mempelajari sifat-sifat koloni/pertumbuhan mikroorganisme.

Berdasarkan kandungannya, media dibedakan menjadi tiga yaitu media sintesis dan media semisintesis.

Media Sintesis

Media sintesis adalah salah satu jenis media yang komposisi zat dan takarannya diketahui dengan jelas.Media sintesis juga merupakan media yang bahannya terbuat dari bahan sintesis atau bahan buatan. Misalnya PDA (Potato Dextrose Agar), PCA (Plate Count Agar) dan NA (Nutrient Agar),  Hal ini sesuai dengan pendapat Pelzcar (2005), yang menyatakan bahwa medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti.

1. Plate Count Agar (PCA)

       PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/l kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121⁰C). Media PCA ini baik untuk mengetahui pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba). Hal ini sesuai karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen kompleks lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks. Mikroorganisme yang ditumbuhkan seperti Bacillus subtilis, Eschericia coli, Lactobacillus casei, Satphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes.

2. Potato Dextrose Agar (PDA)

       PDA merupakan media padat yang digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi khamir dan kapang. Komposisinya ialah kentang 4 gram, Dextrose 20 gram, dan agar 15 gram. Pati kentang sebagai sumber karbohidrat, dextrose sebagai sumber energi, dan agar untuk mengeraskan media. Mikroorganisme yang ditumbuhkan  seperti Saccharomyses cereviceae, Aspergillus brasiliensis dan Trichophyton mentagrophytes.

3. Nutrient Agar (NA)

        Nutrient Agar (NA) adalah medium sintesis yang berfungsi untuk enumerasi  mikroba dan medium kultivasi. NA merupakan media sintesis yang mengandung sumber nitrogen dalam  jumlah cukup sehingga efisien digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Komposisi pembuatan NA yaitu intisari peptikum dan sodium klorida 5 gram; ekstrak daging sapi 1,5 gram dan agar 15 gram. Intisari peptikum sebagai sumber nitrogen, sodium klorida sebagai penyeimbang tekanan osmotik antara medium dan bakteri. Adapun ekstrak daging sebagai sumber karbohidrat, vitamin, dan juga garam. Mikroorganisme yang ditumbuhkan seperti Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhi, Staphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes

Media Semisintesis

Media Semi-sintesis merupakan medium yang sebagian komposisi dan takarannya diketahui secara pasti. Tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetis. Contohnya adalah kentang agar dan touge agar. Hal ini sesuai dengan pendapat Pelzcar (2005), bahawa media semi sintesis yaitu media yang sebagain komposisinya diketahui secara pasti.

1. Kentang Agar

Media kentang agar adalah media semisintesis yang berfungsi untuk menumbuhkan kapang. Komposisinya ialah kentang 100 gr, glukosa 17 gr, agar 4 gr, dan aquades 133 ml. Kentang (extrac potato) sebagai sumber karbohidrat, dextrose (gugusan gula, baik itu monosakarida atau polysakarida) sebagai tambahan nutrisi bagi biakan sedangkan agar merupakan bahan/media tumbuh bagi biakan yang baik karena mengandung cukup air. Pertumbuhan mikroorganisme dapat terjadi apabila mengandung semua nutrisi yang dibutuhkan misalnya karbohidrat, air, protein dan vitamin. Mikroorganisme yang ditumbuhkan seperti Saccharomyces cerevisiae dan Aspergillus oryzae. Media kentang agar dibuat dengan terlebih dahulu kentang ditimbang sebanyak masing-masing 100 gram. Bahan dibersihkan kemudian di caca. Setelah itu, bahan dihaluskan menggunakan blender. Kemudian ditambahkan aquadest 133 mL. Kentang yang telah dihaluskan disaring dan hasil saringannya dimasukkan ke dalam gelas beker, Kemudian tuang ke dalam erlenmeyer. Campurkan dengan gula pasir 17 gram dan agar 4 gram. Masukkan ke microwave untuk pemanasan dan homogenisasi media. Tahap ini dilakukan 3 sampai 4 kali hingga didapatkan larutan berwarna kuning pudar bening. Setelah itu, untuk proses sterilisasi, tutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan aluminium foil. Sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121⁰C  selama 15 menit. Setelah itu disimpan di refrigerator.

2. Tauge Agar

Media tauge agar merupakan salah satu media semisintesis yang berfungsi untuk menumbuhkan khamir dan kapang. Komposisinya ialah tauge 203 gr, agar 8 gr, glukosa 34 gr, dan aquades 600 ml. Tauge berfungsi sebagai sumber vitamin dan senyawa karbon. Agar memiliki komposisi kimia berupa D-galaktosa, 3,6-anhidro-L-galaktosa, D-glucuronic acid. Agar sebagai bahan pembeku akan mencair saat didihkan, kemudian didinginkan pada suhu 40-42^o C sebelum dibekukan. Media agar ini tidak akan mencair lagi kecuali pada suhu 80-90^o C. Agar merupakan agen pengeras yang bagus sekali karena tidak dapat didegradasi oleh mikroorganisme. Mikroorganisme yang ditumbuhkan seperti Scenedesmus, Candida utilis dan Candida albicans. Tauge agar dilakukan dengan terlebih dahulu tauge ditimbang sebanyak masing-masing 203 gram. Dipisahkan bagian akar dan kepala, lalu bagian kepalanya di buang. Bahan dibersihkan kemudian di caca. Setelah itu, bahan dihaluskan menggunakan blender dan ditambahkan sebanyak 600 mL. Tauge  yang telah dihaluskan disaring dan hasil saringannya dimasukkan ke dalam gelas beker, Kemudian tuang ke dalam erlenmeyer. Campurkan dengan gula pasir 34 gram dan agar 8 gram. Masukkan ke microwave untuk pemanasan dan homogenisasi media. Tahap ini dilakukan 3 sampai 4 kali hingga didapatkan larutan berwarna kuning pudar bening. Setelah itu, untuk proses sterilisasi, tutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan aluminium foil. Sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121⁰C  selama 15 menit. Setelah itu disimpan di refrigerator.

Berikut gambar prosedur pembuatan media tauge agar

Tauge dibersihkan

Tauge ditimbang hingga 203 gram

Gula ditimbang hingga 34 gram

Tauge dihaluskan

Dipanaskan dan dihomogenkan dengan microwave

Setelah dipanaskan

Tutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan aluminium foil lalu simpan di dalam refrigerator

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2010. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta :Djambatan

Gruendemann, B.Jdan Fernsebner, B. 2006. Buku Ajar Keperawatan Perioperatif. Jakarta: Kedokteran EGC.

Lansing, M. Prescott, Harley John Pdan Kleien Donald, A. 2005. Microbiology. Sixth Edition. The Mc Graw-Hill Company, Inc, New York.

Pelczardan Michael. 2005. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta:  Universitas Indonesia

Saha, A., Mandal, P., Dasgupta, Sdan Saha, D. 2008. Influence of Culture Media and Environmental Factors on Mycelia Growth and Sporulation of Lasiopdiplodia theobromae (Pat.) Griffon and Maubl. Journal of Enviromental Biology, 29(3):407-410

Soerdikoesoma. 2009. Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Terbuka.

Sunarya dan Yayan. 2000. Mudah dan Aktif Belajar Kimia. Bandung: PT. Setia Purna Invers.

Sylvia. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga